Nature | 探索细胞内胆碱运输系统的神秘面纱—FLVCR1（上）

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在细胞的微观世界中，磷脂双分子层就像细胞的护城河一样，建立起细胞与外界、以及细胞内部各个亚细胞结构之间的屏障。在哺乳动物细胞中，磷脂的两种重要成员——磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，更是细胞膜的主角，占据着总磷脂含量的55%至75%。

你可能会好奇，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是如何被合成的呢？它们通过Kennedy途径进行三步合成，从胆碱和乙醇胺出发，经过磷酸中间体和胞嘧啶二磷酸中间体合成¹。这种合成途径是细胞中最主要的制造过程之一，直接影响着细胞的健康与发育。

而让这一切变得更加有趣的是，研究者们最近发现了一对细胞中的小“使者”——猫白血病病毒亚组C细胞受体1（FLVCR1）和它的“兄弟”FLVCR2，它们被发现是促进细胞内外胆碱摄取的质膜转运蛋白。FLVCR1在小鼠中是细胞生存所必需的，缺乏功能性FLVCR1的小鼠在胚胎发育的第12.5天左右死亡²。而在人类身上，FLVCR1的几个点突变可导致后纵束共济失调和视网膜色素变性，这是一种发病于儿童期的神经退行性综合征，让视力丧失、本体感知异常和肌肉萎缩成为家常便饭³。FLVCR2的突变，则可让人患上Fowler综合征，这是一种以严重脑积水、运动功能减退和关节弯曲为标志的血管障碍⁴。

然而，尽管我们对它们的功能有了初步认识，但对于其内部的结构及运作机制，却仍然知之甚少。因此，为了深入探索这一细胞内运输系统的运输机制，我们首先着眼于FLVCR1，打开通往细胞内运输秘境的大门，揭开FLVCR1的神秘面纱！2024年5月1日，美国纪念斯隆凯特琳癌症中心Richard K. Hite实验室在Nature期刊上发表了题为Structural basis of lipid head group entry to the Kennedy pathway by FLVCR1的论文。本文报道了FLVCR1与胆碱和乙醇胺结合的结构，揭示了FLVCR1如何成为高亲和力的代谢产物转运蛋白，为Kennedy途径两个分支的磷脂生物合成提供了共同起点。

研究者们首先通过实验探究了FLVCR1转运胆碱的能力，结果表明，FLVCR1依赖静息的负膜电位和胆碱在细胞外溶液与胞浆之间的浓度梯度实现对底物的转运（图1a）。

为了确定胆碱识别和转运的机制，研究者解析了人类FLVCR1结合1mM氯化胆碱的冷冻电镜结构，分辨率为2.6 Å。研究者将中央腔顶部的密度指定为一个胆碱分子，胆碱的羟基与Gln214和Gln471残基相互作用，而季铵基与Trp125和Tyr349形成阳离子-π相互作用。此外，与同源结构对比，研究者进一步确定了FLVCR1的向内开放构象（图1b-h）。

图 1 人类FLVCR1胆碱结合状态的冷冻电镜结构

通常来说，一个向内开放、结合底物的状态对应于将底物从细胞外转运后但释放到细胞质之前的状态。为了获得有关转运机制的额外见解，研究者接下来在没有外源底物的情况下解析了FLVCR1的冷冻电镜结构，有趣的是，在这种情况下，研究者获得了两种不同的构象，分辨率分别为2.63 Å和2.42 Å。

第一种状态几乎与结合胆碱的结构相同，中央口袋仍然可以观察到类似的胆碱密度，这一结果也表明胆碱以高亲和力结合到FLVCR1的底物结合位点。第二个状态也采用向内开放构象，但其构象与结合胆碱状态不同。最显著的差异是TM8中的倾斜，导致其胞质末端轻微位移，Gly381和Gly384作为枢轴。在底物结合位点，研究者观察到一个非蛋白质密度，但不同的是，占据底物结合位点的密度太大以至于不可能对应胆碱，但又太小以至于不可能对应之前被提出是FLVCR1底物的血红素（图2）。

图 2 FLVCR1结合内源底物

为了探究FLVCR1的额外底物，研究者使用了癌症依赖图 (DepMap) 项目的CRISPR 23Q2公开评分数据库。结果显示，与FLVCR1关联最强的基因是ETNK1，它编码的乙醇胺激酶1催化Kennedy途径的乙醇胺分支的第一步。此外，还可以识别出FLVCR1与PCYT2之间的关联，PCYT2编码的磷酸乙醇胺胞嘧啶基转移酶 (CTP) 催化Kennedy途径乙醇胺分支的第二步。尽管乙醇胺激酶1和CTP并非绝对特异于Kennedy途径的乙醇胺分支，但这些遗传关联表明，除了为进入Kennedy途径获取胆碱的作用外，FLVCR1还可能对Kennedy途径的乙醇胺分支起到一定贡献（图3a-b）。

为了确定FLVCR1是否可以运输乙醇胺，研究者比较了HEK293T野生型细胞和FLVCR1基因敲除型细胞对乙醇胺的摄取情况。令人惊讶的是，在FLVCR1基因删除后，乙醇胺的摄取能力下降了93%，这表明FLVCR1是这种细胞类型中乙醇胺摄取的主要途径。同样的，FLVCR1基因删除后，细胞对胆碱的摄取能力下降得甚至更多。在比较胆碱和乙醇胺的摄取时，研究者发现乙醇胺是FLVCR1的优先底物，亲和力更高（图3c-h）。值得注意的是，FLVCR1对底物的亲和力与血浆中乙醇胺（约2μM）和胆碱（约10μM）的浓度非常相似，表明FLVCR1可以作为高亲和力的胆碱和乙醇胺转运蛋白。

图 3 FLVCR1通过常见的途径转运乙醇胺和胆碱

为了确定FLVCR1如何识别和运输乙醇胺，研究者解析了FLVCR1结合1mM乙醇胺的冷冻电镜结构，同样地分出了两个向内开放构象，分辨率为2.5 Å和3.02 Å，两种状态之间唯一显著的区别是占据底物结合位点的密度的形状。在较低分辨率重建中，底物结合位点的密度与胆碱结合状态中解析的胆碱密度重叠，表明高浓度的乙醇胺可能不足以完全竞争掉底物结合位点的内源胆碱。较高分辨率重建的底物结合位点密度较小，很好地容纳了一个乙醇胺分子。

尽管乙醇胺和胆碱与FLVCR1结合的位置相同且不改变转运蛋白的全局构象，但乙醇胺和胆碱与FLVCR1的相互作用方式不同。与胆碱的季铵基相比，乙醇胺的主氨基在底物结合口袋内向TM2移动了1.3 Å，乙醇胺在芳香口袋内部的更深位置使其主氨基能够与Gln214的侧链相互作用，而Gln214与胆碱的季铵基直接相互作用太远。此外，为了验证结构信息，研究者还构建了底物口袋单点突变体，并测量了突变体对两种底物的摄取能力，实验结果与结构分析相对应。因此，结构信息与功能实验共同表明，Gln214在通过与其主氨基和羟基相互作用来识别乙醇胺中发挥了独特关键作用。尽管FLVCR1通过一个共同的途径转运乙醇胺和胆碱，但稳定这些代谢物的相互作用因它们独特的化学性质而异。

接下来，研究者检查了FLVCR1对细胞中Kennedy途径的两个分支的乙醇胺和胆碱转运是否有贡献。结果表明，缺乏FLVCR1的细胞在将标记的胆碱转化为磷胆碱或下游代谢物甜菜碱的过程中，与野生型相比，减少了99%。同样，FLVCR1的丧失严重削弱了将标记的乙醇胺转化为磷乙醇胺的过程。并且与结构分析相对应，回补表达FLVCR1 Q214A突变体能挽救胆碱转化为磷胆碱，但不能挽救乙醇胺转化为磷乙醇胺。总的来说，这些结果表明，FLVCR1是一种负责吸收乙醇胺和胆碱以供给Kennedy途径两个分支的转运蛋白。

图 4 FLVCR1为Kennedy途径的两个分支提供能量

Kennedy途径通过磷脂合成提供了细胞增殖所必需的磷脂磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。在这里，研究者揭示了FLVCR1是一种转运蛋白，作为它们合成的共同入口点，将细胞外的胆碱和乙醇胺转运到细胞质中，可以被胆碱激酶-α和乙醇胺激酶1磷酸化，分别催化Kennedy途径胆碱和乙醇胺分支的第一步骤。此外，研究者还解析了FLVCR1分别结合这两种底物的高分率结构，底物稳定了略有不同的向内构象状态，其中中央腔扩大，表明FLVCR1可以结合几种底物，并且这些底物可以稳定不同的状态。未来的研究将需要揭示底物释放的机制，这可能需要局部或全局构象变化。这项工作为我们理解细胞内胆碱和乙醇胺运输过程提供了重要线索，为治疗相关疾病提供更深入的认识和可能的治疗途径。

供稿 | 肖媛

审核 ｜谭佳鑫

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07374-4

参考文献

参考文献

[1] Kennedy, E. P. Sailing to Byzantium. Annu. Rev. Biochem. 61, 1–28 (1992).

[2] Kenny, T. C. et al. Integrative genetic analysis identifies FLVCR1 as a plasma-membrane choline transporter in mammals. Cell Metab. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.04.003 (2023).

[3] Khan, A. A. & Quigley, J. G. Heme and FLVCR-related transporter families SLC48 and SLC49. Mol. Aspects Med. 34, 669–682 (2013).

[4] Kvarnung, M. et al. Mutations in FLVCR2 associated with Fowler syndrome and survival beyond infancy. Clin. Genet. 89, 99–103 (2016).

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